土壤中微生物分离纯化电子版实验报告

微生物实验报告

土壤中微生物的分离与纯化

【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化

【关键词】土壤 、微生物、菌落观察、分离纯化

1.实验目的

（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。

（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。

（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。

2.实验原理

（1）培养基的配制与灭菌

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。

（2）微生物的培养及鉴定

接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。

　接种的关键是要严格的进行无菌操作。

鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。

（3）平板分离与活菌计数

倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。

划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。通过划线将样品在平板上稀释，培养后能形成单独的菌落。平板计数法是将测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计并记录菌落数。

（4） 细菌的分离与纯化

为了得到单一菌种，要对培养的菌分离和纯化。用接种环挑起培养基里少量菌在无菌条件下接种到新的培养基上，划线，继续进行培养，从而得到新的单一菌落。

3.实验器材

（1）器材：

培养皿、载玻片、 量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种

环、镊子、 恒温培养箱、高温灭菌锅、 无菌操作台 、 天平、滤纸、pH试纸等 。（2）试剂：

配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、

配置高氏 = 1 \* ROMAN I号培养基的原料（ 可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4，MgSO4· 7H2O，

NaCl，FeSO4· 7H2O，琼脂 ，pH=7.4-7.6）

配制查氏培养基的原料（硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚

铁、蔗糖、琼脂、蒸馏水）

配制无氮培养基的原料（葡萄糖，K2HPO4，MgSO4· 7H2O，

NaCl，CaSO4· 2H2O， CaCO3，pH=7.0-7.2）

（3）菌种：

土壤稀释液

4.实验步骤

（1）高氏培养基的配制

eq \o\ac(○,1)培养基的配方：

可溶性淀粉 ········································20.0 g KNO3············································1.0 g K2HPO4 ··········································0.5 g MgSO4? 7H2O·······································0.5 g NaCl ············································0.5 g FeSO4? 7H2O·······································0.01 g 琼脂 ·············································20 g 自来水 ········································1000 mL

pH ··········································7.4－7.6

淀粉琼脂培养基（高氏一号），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。

eq \o\ac(○,2)操作流程：

称量→溶解→分装→包扎→灭菌

* 调PH一步省略不做

eq \o\ac(○,3)操作步骤：

a.称量和溶解：按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉

调成糊状，再加入小于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全熔化。然

后再称取其它各成分依次熔化。对微量成分 FeSO4·7H2O可先配成高浓度的储备

液，按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的 FeSO4·7H2O，配

成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加入1mL的0.01g/mL的贮备液即可。待所有

药品完全溶解后补充水分都所需的总体积。将称好的琼脂放入上述已溶的药品中，

加热使琼脂熔化，期间不断搅拌，最后补足加热过程中损失的水分。

注意：琼脂熔化过程中应控制火力，一面培养基因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅

拌，以防琼脂糊底烧焦。

b.分装：将配好的液体培养基均匀装入8支试管，每支试管的液体量以倾斜试管液

体恰好成对角线铺满试管为标准。剩余培养基液体分装入两个三角烧瓶。

c.加塞包扎：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微

生物进入培养基内造成污染。并用牛皮纸包住试管口和三角烧瓶口，皮筋固定。

并在试管和三角烧瓶全身包上报纸。用记号笔标好培养基名称、组别、配制日期。

d.灭菌：将上述培养基以0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

（2）微生物的培养

eq \o\ac(○,1)倒平板:

将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 = 1 \* ROMAN I号培养基、查氏培养基、无氮培养基加热

融化，在无菌操作台上将其倒在16个培养皿中。

其中牛肉膏蛋白胨培养倒9个平板、高氏 = 1 \* ROMAN I号培养基倒3个平板、查氏培

养基倒3个平板、无氮培养基倒1个平板。

* 倒平板的方法：

倒平板主要有两种方法：皿架法和手持法

我们采用手持法倒平板，具体操作如下：

右手持三角瓶至于火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻拔出，保持瓶口对准火焰，左

手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻

轻摇动培养皿是培养基铺平培养皿底部，然后平置于桌面上冷凝。

eq \o\ac(○,2)制备土壤稀释液:

称取1g花园土，无菌操作倒入99mL无菌生理盐水中,在震荡器中振荡20

分钟, 使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-2稀释液；再用 lmL移液器，

吸取10-2稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，

即成10-3稀释液；再换一支无菌吸头吸取10-3稀释液lmL，移入装有9mL无菌

水的试管中，振荡，即成10-4稀释液；以此类推，连续稀释，制成 10-2、10-3、

10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液（如下图）

eq \o\ac(○,3)涂布：

将培养基平板编号，然后用移液枪吸取10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液各

0．2mL对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（牛肉膏蛋白胨培养基每个编

号设三个重复，查氏、高氏各一个）。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀

（如下图），每个稀释度用一个灭菌涂布棒；更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。

无氮培养基接种用点液法。

*涂布方法：

将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分散均匀，然后改变方向90℃沿

另一直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布棒再涂布几次，室温下静置

5~10min。

eq \o\ac(○,4)培养:

将涂布好的平板平放于桌上10～20min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板

倒转。牛肉膏蛋白胨培养皿置于37℃培养箱中、高氏 = 1 \* ROMAN I号、查氏、无氮培养皿置

于28℃培养箱，两天后观察。

eq \o\ac(○,5)记录并观察各菌落的生长情况。

（3）平板划线分离微生物

连续划线分离：

在近火焰处啊，左手拿皿底，右手拿接种环，挑使用接种环，从待纯化的菌落

或待分离的斜面菌种中挑取少量菌样，在相应培养基平板划线分离（如图），划

线的方法多样，目的是获得单个菌落。

5、实验结果记录

(1) 各培养基上菌的生长情况

eq \o\ac(○,1)牛肉膏蛋白胨培养基 ——细菌 eq \o\ac(○,2)查氏培养基——霉菌

eq \o\ac(○,3)高氏培养基——放线菌 eq \o\ac(○,4) 无氮培养基——无氮菌

划线分离后细菌落图

(2)不同菌落形态特征的描述

菌落特征记录表

菌落名称

细菌

放线菌

霉菌

固氮菌

菌落特征

大小

大

小

大

中

形态

圆形

圆形

不规则

不规则

干湿

湿润

干燥

干燥

粘稠

高度

扁平

扁平

隆起

隆起

透明度

半透明

不透明

不透明

半透明

颜色

黄色

淡粉色

绿色

乳白色

边缘

不整齐

整齐

不整齐

不整齐

（3）平板菌落计数结果

10-4

平均

10-5

平均

10-6

平均

牛肉膏

30

26

4（有污染)

20

15

12

16

19

3（有污染)

5

4

4

查氏

23

17

7

高氏

7

5

4

无氮

0

原始数据记录

CFU记录表

稀释度

菌种

10-4

平均

10-5

平均

10-6

平均

细菌

1.5e6

1.3e6

0.2e6

1e6

7.5e6

6e6

9e6

7.5e6

1.5e7

2.5e7

2e7

2e7

霉菌

1.15e6

-

8.5e6

-

3.5e7

-

放线菌

3.5e5

-

2.5e6

-

2e7

-

* 每毫升中的cfu数=同一稀释度三次重复的平均菌落数*稀释倍数*5

6.实验结果与讨论

（1）实验中的问题及原因分析：

eq \o\ac(○,1)制备培养基时出现的问题：加热熔解琼脂时液体剧烈沸腾溢出三角烧瓶，导致实验重新进行，浪费了人力物力，由于搅拌不够，出现了糊底的现象。以后的实验中要引起足够的重视

eq \o\ac(○,2)接种操作时没有尽量避免外界细菌的掺入，使得最后培养得到的菌落掺杂了空气中的杂菌，而在灼烧接种环时因接种环过热使得一部分菌体被杀死。

eq \o\ac(○,3)无氮培养基没有长出无氮菌，本组用的无氮培养基太薄，再加上土壤稀释液点的太多，本来无氮菌在土壤稀释液中就不多，使得大部分固氮菌因没有营养而死。

eq \o\ac(○,4)划线时没有严格按照老师的标准，再加上操作不熟练，划的线太过稀疏，分离不明显，未得到太多的单一菌落

(2）总结：

第一次微生物实验，感觉还是比较新鲜的。很多操作上的技巧还需要通过不断的实验区熟练掌握，比方说尽量无菌操作。因为第一次微生物实验，无菌操作不规范导致实验出现了很多问题，以后要在实验中逐步改进。其次应该加强理论课学习以便更好的理解和操作实验。

2012-5-10